REPORTE DE PRACTICA

PRACTICA: EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE DNA.

ANTECEDENTES: además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los ácidos nucleídos  (DNA Y ARN) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas, son moléculas complejas producidas por las células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

OBJETIVO: 

Extraer DNA y ARN de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL.

v  Tubos de centrifuga 1 ml

v  Tubos de ensayo de 5 ml

v  centrifuga

v  micro pipetas de 1000 y 200 ul

v  agua destilada estéril

v  etanol al 100 % frio

v  NaCl 3 M

v  Buffer de extracción de DNA

v  Fenol

v  Mortero y pistilo

v  Hígado de res

v  Papel aluminio

v  Guantes

PROCEDIMIENTO

A)   Rompimiento de membranas y paredes celulares

Toma una muestra del tejido (5 gr aprox) del hígado de res y homogenizalo, es decir muélelo en el mortero, si el tejido es muy duro licúalo en seco.  

B)   Digestión

Coloca la muestra molida (1 gr aprox) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégale el buffer de extracción a temperatura de cuarto (500 ul aprox)   

Cuando hayas agregado el buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C)   Separación de proteínas, carbohidratos y  lípidos

A la mezcla que tienes en un tubo de ensayo agrégale 500 ul de fenol, usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, dejando reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extrae la fase acuosa (500 ul aprox) con una micro pipeta, si no se separan las fases centrifuga a 1000 rpm por 5 minutos a una temperatura de 6° C, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

      

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugado.

D)   Separación de ácidos nucleicos DNA y ARN

A la fase acuosa que extraes (500 ul), colócala en un tubo de eppendorf limpio y agrégale 400 ul, de etanol (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M, mezcla por inversión, suave y observa cómo se precipita el DNA.

RECUPERACIÓN DE LA PASTILLA

Centrífuga tú tubo por 2 minutos a 1000 rpm a temperatura de 6° C y recoge la pastilla del fondo del tubo.

  

RESULTADOS

Finalmente se logro obtener fragmentos de DNA en la muestra de tejido de hígado de res, la cual se coloco en un tubo de eppendorf para que se pudiera conservar de manera adecuada la pastilla de ADN.

Como podemos observar después de la centrifugación se logro obtener biomoleculas por separados que dando de la siguiente manera como base o en la parte de abajo encontramos las proteínas, enseguida una capa delgada de carbohidratos y por último el acido nucleico. 

CUESTIONARIO

¿Porque el ADN en solución se precipita en presencia de un alcohol frió?

Porque el alcohol hace que el ADN se altere su composición y se vuelva muy pesado esto hace que se precipite y se concentre en la parte baja del tubo de eppendorf

¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

Se utiliza la espectrofotometría utilizando un rango de luz UV, debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del ADN, que absorben máximo a 260 nm.

Espectroscopía de UV. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA.

¿Cuál es la función y la importancia del DNA en los organismos?

Tiene la función de conservar la información genética de cada individuo empaquetado para que la descendencia cuente con sus características,  esto nos da gran importancia porque así mismo puede duplicarse la información y es uno de las principales biomoleculas ya que si llegara a faltar la vida no existiría.

BIBLIOGRAFIA.

www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-dna.pdf

www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html

viaclinica.com/article.php?pmc

CONCLUSION

 CONCLUSION

En el desarrollo de esta unidad logre conocer cada paso que tiene que ocurrir para que el material genético pueda ser replicado así como la intervención de enzimas que son importantes para la replicación, ya que algunas intervienen para que la cadena de ADN pueda separarse en dos hebras que como ya se estudió servirán para tener copias idénticas al antecesor, así también una de las más importantes que es la que permite copiar la información de la hebra antigua en una hebra nueva como es la enzima ADN polimerasa. También en esta unidad conocí los pasos para realizar PCR que es una técnica que permite sintetizar un gen pero con la intervención de la mano del hombre esta prueba es común realizarla en casos de investigación, además del material a utilizar que nos permitirá realizarla.

INVESTIGACIÒN DE LOS TEMAS

REPLICACIÓN  EN  EUCARIONTES

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. Existe una hebra conductora y una hebra retrasada con fragmentos de Okazaki. La diferencia, se comienza con las polimerasas, son más complejas, y además, la polimerasa de la hebra continua es diferente a la de la hebra discontinua. De la hebra continua se encarga la polimerasa Delta y de la discontinua, la Alfa.
Las helicasa difieren en estructura, las primasas se encuentran adosadas a la ADN-pol Alfa.
El resto del proceso es muy parecido.
En el final de la hebra antigua que da la base a la hebra discontinua, queda una zona denominada telómero, que no tiene como obtener su dupla en la hebra discontinua, debido a que no es posible insertar un nuevo ARN cebador, ni mucho menos un fragmento de Okazaki. Al no tener su par, son eliminados automáticamente, perdiéndose. Existen enzimas, las telomerasas, que repiten esta secuencia varias veces, cosa que no se pierda información esencial del genoma. Las enzimas encargadas de cortar el telómero, son las topoisomerasas 4.
El ARN cebador es retirado por el complejo de reparación de la célula.
Los nucleótidos trifosfatos (en la formas de ATP, GTP, CTP y TTP) se enganchan de acuerdo al modelo semi-conservativo . Otros detalles de la replicación del ADN son consistentes con los hallazgos en procariotas. El ADN eucariota tiene muchas horquillas de replicación y también síntesis bidireccional. El ADN eucariota se sintetiza mucho más lentamente que el procariota, en humanos, a unos 50 nucleótidos por segundo y por horquilla de replicación. Luego de la replicación el nuevo ADN se asocia inmediatamente con histonas.
 

Las ADN polimerasas eucarióticas tienen una diferencia interesante con las ADN polimerasas de E. coli, ya que se utilizan dos polimerasas diferentes una para sintetizar la hélice conductora y otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa α sintetiza la hélice retardada mientras que la ADN polimerasa δ sintetiza la hélice conductora. En la siguiente tabla se resumen las polimerasas de mamíferos






CONTROL DE LA REPLICACIÓN

La transmisión de la información genética entre generaciones y la expresión en forma de proteínas de dicha información genética no son suficientes para permitir que el programa de desarrollo de un organismo se lleve a cabo correctamente. Es necesario, además, asegurar que los genes que constituyen la información genética transmitida se expresen en momentos adecuados bien desde el punto de vista cronológico o espacial (procesos de desarrollo) o bien como respuesta a cambios en las condiciones ambientales en las que se encuentra la célula o el individuo. Por otra parte, las respuestas al ambiente o los procesos de desarrollo no suelen producirse como con secuencia de la activación de un único gen en un momento, sitio o condición determinado, sino que suele ser necesaria la expresión coordinada de un conjunto de ellos para que tenga lugar el efecto. Estos dos hechos hacen que el control de la expresión génica sea central en el proceso de la biología molecular de los seres vivos.
El modelo más coherente de regulación de la expresión génica se conoce con el nombre de Modelo del Operón que explica, como veremos, la expresión coordinada de genes. Por otra parte, veremos a continuación cuál es el proceso por el que llega al material genético la in formación ambiental o de desarrollo que permita la expresión coordinada; estudiaremos el proceso de transducción de la señal.
2.1.- Modelo del operón: La expresión de un grupo de secuencias codificantes de diferentes péptidos cuya presencia debe ser coordinada se logra colocando todas las secuencias bajo el control de un mismo promotor.
La transcripción de todas estas secuencias darán lugar a un ARN mensajero de gran tamaño que codifica todos los genes contenidos en el operón (ARN policistrónico) de forma que siempre se podrán traducir coordinadamente las diferentes proteínas del operón. La cantidad de cada una de las proteínas del operón que se produce como consecuencia de la traducción no siempre es equimolecular porque existen elementos de regulación de la traducción que provocan la separación del ribosoma y el ARNm en ciertos momentos controlando así más finamente la coordinación de la expresión.








 REPLICACIÓN DEL ADN IN   VITRO

La estrategia para secuenciar un genoma completo conlleva a la fabricación de librerías genéticas. El proceso se facilita cuando se quiere aislar un gen y se conocen al menos algunas partes de él (por ejemplo la secuencia amino o carboxilo de la proteína para la que codifica), lo cual reduce el número de copias de segmentos de ADN que deben ser amplificados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR del inglés). Esta reacción fue utilizada por primera vez por Kary Mullis en 1983. El ADN amplificado puede ser clonado directamente o usado en una gran variedad de procedimientos analíticos.
El PCR es un técnica muy simple: dos oligonucleotidos son sintetizados cada uno como secuencia complementaria de una hebra opuesta (secuencia de un segmento en cada una de las hebras) del ADN blanco en posiciones que estén más allá de aquellas donde termina el segmento a ser amplificado. Los oligonucleótidos sirven como cebadores con sus extremos 3' orientados en direcciones opuestas.

El ADN  aislado que contiene el segmento a ser amplificado es calentado levemente para ser desnaturalizado (separado en hebras sencillas), después se enfría en presencia de grandes cantidades de los oligonucleótidos sintéticos, lo que permite que por hibridación, se encuentren las secuencias complementarias. En este momento se agregan los cuatro desoxiribonucleotidos trifosfato y el segmento hibridado sirve como cebador para iniciar la amplificación. El proceso de calentamiento y enfriamiento se lleva a cabo unas 25-30 veces en algunas horas en un aparato que lo hace automáticamente, hasta que el fragmento puede ser analizado o clonado.

Los segmentos son amplificados utilizando una ADN polimerasa resistente a los cambios de temperatura como la TaqI polimerasa (aislada de una bacteria hipertermófila). Si se diseñan con cuidado los cebadores de tal forma que contengan sitios de corte para endonucleasas, se puede facilitar mucho la clonación del ADN amplificado.

Con esta técnica se han podido amplificar segmentos de ADN de 40,000 años de antigüedad como momias humanas y animales extintos como el mamut, lo que ha dado origen a la arqueología molecular y a la paleontología molecular. Se utiliza mucho esta técnica para rastrear el origen de los virus humanos y en estudios forenses (southern blot).

BIBLIOGRAFIA


http://schoolworkhelper.net/wp-content/uploads/2011/06/PCR1.jpg
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm
http://www.angelfire.com/bc2/biologia/adn2.htm
laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/pcr.htmL
www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.htm

apuntes de la clases

CDK… Quinasas dependientes de ciclinas en levaduras C. Servicea
REPLICACION IN VITRO
PCR; Reacción en cadena de la polimerasa.
Consta de 3 pasos
1.- calentar para que las cadenas de ADN se separen se calientan en una temperatura a 95º C
2.- enfriar añadir los cebadores a temperatura de 70º C
3.- añadir el ADN polimerasa termoestable para catalizar la síntesis de DNA en dirección 5’ a 3’

Este ciclo tiene una duración de 6 minutos.
El termociclador es un aparato que sirve para hacer PCR

UNIDAD 4 REPLICACION DEL ADN

INTRODUCCION.

La transmisión de información implica que el ADN es capaz de duplicarse de manera de obtener dos moléculas iguales a partir de la molécula inicial. Este proceso se llama replicación.

Luego del descubrimiento de la estructura del ADN, en 1957, dos biólogos moleculares, Matthew Stanley Meselson y Frank Stahl demostraron que este se replica de una manera semiconservativa, es decir que la nueva cadena se sintetiza utilizando una de las hebras preexistentes como molde. Las moléculas de ADN “hijas” están formadas por una cadena nueva y una original que sirve como molde.

En la replicación participan varias enzimas. Las ADN polimerasas sintetizan una nueva cadena de ADN. Para esto utilizan como molde una de las hebras y un segmento corto de ADN, al que se le agregan los nuevos nucleótidos. Este segmento funciona como cebador (primer, en inglés). La ADN polimerasa agrega nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en crecimiento.

Otras enzimas que participan en este proceso son: la ADN primasa (que sintetiza el primer de ARN), la ADN ligasa (que une extremos 5’ con 3’ que hayan quedado luego de la síntesis), la ADN helicasa y las ADN topoisomerasas ADN (que evitan que el ADN se “enrede” en el proceso), las roteínas de unión al ADN (facilitan la apertura de la doble hebra).

Modelo Semiconservativo: Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hélice indicaron que dicho modelo sugería una forma sencilla de replicación. El modelo de replicación propuesto por Watson y Crick suponía que el ADN doble hélice separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariadad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo recibió el nombre de Semiconservativo, ya que las dos dobles hélices recién sintetizadas poseen una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad nueva).

Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon otros posibles modelos de replicación del ADN, uno de ellos se denominó Modelo Conservativo y otro Modelo Dispersivo.

Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica se producen dos dobles hélices, una de ellas tienen las dos hebras viejas (esta intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes proporciones.

REPLICACIÓN EN PROCARIOTES

Cairns en 1963, llevó a cabo otro experimento en la bacteria E. coli que además de demostrar que la replicación de su ADN se ajustaba al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953), también demostraba que el ADN de E. coli es circular.

Cuando las moléculas de ADN circular se replican se observan lo que se denominan "ojos o burbujas" de replicación. La forma que adoptan los intermediarios de la replicación se parece a de la letra griega  θ. 

Como ya hemos visto la replicación en bacterias se ajusta al modelo semiconservativo. En las bacterias existe un solo origen de replicación, denominado Ori C y, a partir de este único punto de origen, la replicación progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación. El cromosoma bacteriano ser una unidad de replicación se le denomina replicón.

En la bacteria E. coli Arthur Kornberg encontró tres ADN polimerasas diferentes, la ADN Pol I, ADN Pol II y ADN Pol III.

La ADN Pol III y la ADN Pol I son las enzimas que intervienen directamente en la replicación del ADN de E. coli. La ADN Pol I tiene un papel reparador, retira los cebadores con su actividad exonucleasa 5'- 3' y rellena el hueco con su actividad polimerrasa 5'- 3'. 

A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una función reparadora, pero la muchas de sus características y el papel que juega en la replicación del ADN, si es que juega alguno, son desconocidas.

La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayoría de la replicación del ADN, el corazón catalítico del enzima lo constituyen las subunidades a (encargada de la polimerización), e (realiza la función correctora de pruebas). Realmente, el complejo enzimático que lleva a cabo la replicación es un multímero denominado Holoenzima de ADN Pol III que posee muchas cadenas o subunidades polipeptídicas. Este multímero es realmente un dímero asimétrico, una mitad del dímero se encarga de sintetizar la hélice retardada y la otra mitad sintetiza la hélice conductora. La subunidad t interviene en la unión del dímero, el complejo g-d produce la unión al ADN molde y la subunidad b sujeta el enzima al ADN.

Las ADN polimerasas de E.coli (las enzimas encargadas de sintetizar ADN) solamente saben sintetizar ADN en la dirección 5' - 3'. Es decir, solamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3' OH de otro nucleótido trifosfato. Las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que añadir nucleótidos trifosfato para comenzar la síntesis de ADN.

La replicación del ADN en E. coli es bidireccional, ya que a partir de un punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación. Cuando se mira solamente una de las horquillas de replicación, una de las hélices se sintetiza de forma continua, la hélice conductora (también llamada hélice líder), mientras que la otra hélice se sintetiza de manera discontinua, hélice retardada (también llamada hélice retrasada), a base de fragmentos cortos. Si se observan simultáneamente las dos horquillas de replicación, a un lado del origen la hélice de nueva síntesis se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma discontinua.

Debido al antiparalelismo de las dos hélices del ADN y a que las ADN polimerasas solamente saben sintetiza ADN en la dirección 5'P - 3'OH, la síntesis de una de las hebras se puede realizar de forma continua, mientras que la otra hélice para poder sintetizarla al mismo tiempo se necesita polimerizarla a base de ir añadiendo pequeños fragmentos (fragmentos o piezas de Okazaki). Como una hélice se sintetiza de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la Replicación es Semidiscontinua.

La síntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un  corto segmento de ARN denominado cebador, dicho cebador lo sintetiza un enzima denominado Primasa. La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza como molde ADN. Todos los fragmentos de Okazaki comienzan por un Cebador. Posteriormente, la Holoenzima de ADN polimerasa III lleva a cabo la síntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta llegar al siguiente cebador. En ese momento, la ADN polimerasa I sustituye a la Holoenzima de ADN polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN cebador mediante su actividad exonueótídica 5'P - 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN.

Por último, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, es necesario enlazar el extremo 3'OH de un fragmento con el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado y unión de los sucesivos fragmentos la realiza la Ligasa.

BIBLIOGRAFIA

v  http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

v  http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/estado-del-arte/como-se-encienden-y-apagan-los-genes-el-dogma-central-de-la-biologia-paso-a-paso/transcripcion.php

apuntes de la clase

UNIDAD 4. REPLICACIÓN DEL ADN

APUNTES DE LAS CLASES BIOLOGIA MOLECULAR

La cadena de ADN tiene un tipo de replicación la cual se llama SEMICONSERVATIVA, que consiste en la separación de las cadenas donde una hebra antigua, da origen a una hebra nueva  mediante la replicación de las bases de la hebra antigua  con la ayuda de enzimas y vuelve a formar la doble cadena.

Se le llama semiconservativa porqué hay presencia de una hebra antigua y una hebra nueva. La principal enzima que se encarga de copiar las bases nitrogenadas se llama ADN POLIMERASA.

Se le llama horquilla de replicación cuando el ADN comienza a separarse.

La enzima qué se encarga en separar las 2 cadenas mediante el rompimiento de los puentes de hidrogeno se llama HELICASA.

Otra enzima fundamental en la separación del ADN es la TOPOISOMERASA, esta se encarga de desenrollar el ADN y  se realiza en la burbuja de replicación.

La proteína de unión a  cadena sencilla (SSB) evita que el ADN se pueda pegar cuando apenas se separaron.

También para  la replicación del ADN es necesaria la implementación de un PRIMER  o CEDADOR que es una molécula  utilizada para que el ADN se pueda pegar.

El primer está compuesto por  o 20 nucleótidos.

En el experimento de Mesensol y Stahl comprobaron que el ADN replicado estaba formado por una hebra de la cadena antigua y una hebra nueva la cual había sido replicada con la intervención de las enzimas antes mencionadas. Ellos marcaron el nitrógeno de las bases nitrogenadas que componen el ADN con nitrógeno 15 y así observaron como la cadena se dividía en dos y formaba organismos que presentaban la información de cadena antigua y la cadena nueva, con esto se comprobó que la cadena de ADN es semiconservativa.

LIGASA: se encarga de unir con enlaces fosfodiester los fragmentos de Okazaki con el ADN POLIMERASA I

¿Por qué se forman los fragmentos de Okazaki?

1.- por qué el ADN POLIMERASA solo copia de 5´a 3’ y es por eso que tiene que dar una vuelta para que copie las dos cadenas, y es por eso que se forma una vuelta.

Para que el ADN de las procariontes se puede replicar debe existir una zona o región rica en adenina y timina ya que al replicar la cadena no debe perder mucha energía así que entre mas adenina y timina exista menos energía se pierde al romper los enlaces de hidrogeno.

Características:

Tiene un origen de replicación

Es bidireccional.

Funciones:

DNA POLIMERASA III: es la que se encarga de copiar el DNA de la cadena antigua en la cadena nueva.

DNA POLIMERASA I: es la que copia los espacios libres que no fueron copiados por los fragmentos de Okazaki

El ADN POLIMERASA III es una Holo_ enzima   y está compuesta por 7 subunidades, pero casi trabajan 5:

Ø  Alfa

Ø  Beta

Ø  Gamma

Ø  Delta

Ø  Teta

Ø  Épsilon

Ø  Tau

REPLICACION EN EUCARIOTES

CARACTERISTICAS DE LA REPLICACIÓN:

v  Hay muchos sitios de origen de replicación

v  Existen varias burbujas de replicación

v  Trabaja la Topoisomerasa I, II

v  En los organismos eucariontes hay 5 DNA POLIMERASA (α, β, γ, δ, ε)

FUNCIONES:

α: replica el DNA cromosomal (hebra rezagada)

β: reparación

γ: replicación del DNA mitocondrial

δ: replicación del DNA cromosomal (hebra guía)

v  Son más lentas todas las enzimas, pero al final son más rápidas porque hay una gran cantidad de enzimas.

v  Fragmentos de Okazaki son más cortos de 40 a 300 pares de bases.

v  Hay intervención de Telomerasas que es una enzima que ayuda a cortar telomeros al finalizar la replicación.

PROCARIONTES

o   Existe un sitio de origen de replicación

o   Nada mas hay una burbuja de replicación

o   Nada mas trabaja la Topoisomerasa II

o    En procariontes hay 3 tipos de ADN POLIMERASA I, II, III

o   Fragmentos de Okazaki son largos de aproximadamente 1000 pares de bases