En
esta unidad logre comprende las técnicas que se utilizan para la purificación
del ADN, así también la función que tienen los marcadores moleculares para la realización
de pruebas o técnicas de hibridación donde se realizan estudios ya sea de
paternidad o de alguna enfermedad, pudiendo detectar la información con tiempo
y poder darle un tratamiento adecuado, así también de cómo se debe llevar a
cabo estas técnicas para poder obtener un buen resultado, pero también los
elementos con los cuales se lleva a cabo este
tipo de estudio. En las técnicas de hibridación ya sea la de Southern Blot o la de Northern
Blot se realiza una fragmentación del ADN mediante
el que se conocerá la información deseada, con la ayuda de los marcadores
moleculares. Otra técnica para la identificación de enfermedades u otro dato se
utiliza la técnica de PCR que es muy sencilla y tiene un grado de confianza muy
alto. Pero también en esta unidad se estudio la manera en que las bacterias o las células eucariotes puede recombinarse el material genético.
lunes, 11 de junio de 2012
martes, 5 de junio de 2012
unidad 10
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
UNIDAD
10: TECNICAS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
QUE PRESENTA:
ELVIRA ROJAS NAVA.
09930053
LICENCIATURA EN BIOLOGIA
6° SEMESTRE.
CIUDAD
ALTAMIRANO GRO. MEXICO, JUNIO DEL 2012
INTRODUCCIÓN.
Las
células son las unidades funcionales de cualquier organismo vivo. Las
instrucciones necesarias para dirigir sus actividades están contenidas en los
cromosomas del núcleo celular y son
conocidas en su conjunto como información genética. La información genética se
encuentra almacenada en el acido desoxirribonucleico (DNA) en forma de un
código, denominado código genético. Un segmento de DNA de localización
cromosómica precisa que contiene el código para un producto (proteína o RNA) de
función definida se denomina gen. La información del gen es transferida a los
diferentes compartimentos celulares a través del ácido ribonucleico (RNA) y es transmitida
de una célula madre a las hijas por duplicación del material genético (DNA).
Los
procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisión de la
información genética en la célula constituyen la materia de estudio de la biología molecular. La biología
molecular puede ser definida como una disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular.
Se fundamenta en un “dogma central”, que establece el flujo de la información
genética en la célula (DNA, RNA y Proteína).
Para
el estudio de la transferencia y la transmisión de la información genética, los
biólogos moleculares han desarrollado técnicas
que permiten la manipulación de los ácidos nucleicos (DNA y RNA),
denominadas técnicas del DNA recombinante; con este mismo fin han propuesto y
perfeccionado procedimientos para el estudio de los productos de la expresión
de los genes (RNA y proteínas).
La
medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las técnicas de la
biología molecular en el estudio de las
enfermedades humanas.
El
impacto de la biología molecular en las
ciencias médicas se vio
potenciado por el “Proyecto Genoma
Humano”, investigación multinacional que estableció la secuencia de bases del DNA
contenido en los cromosomas humanos. El Proyecto del Genoma Humano ha logrado determinar
el orden preciso de los cerca de 3,200 millones de nucleótidos del genoma y
elaborar un mapa que ubica a sus 30 a 40 mil genes. Para la medicina, el
conocimiento de la secuencia completa del DNA humano constituye una poderosa
herramienta para la investigación en biomedicina que ha permitido el avance en
el conocimiento de la patogenia, el desarrollo de nuevas terapias y la
implementación de métodos diagnósticos precisos
OBJETIVO EDUACIONAL.
Conocer
y aplicar las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el
mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.
DESARROLLO DE LA UNIDAD
Extracción y purificación de los
ácidos nucleicos
Todos los
tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a
permitir el desarrollo de un método de separación especifico para ellas. Estos
métodos deben ser completamente bio_compatibles para que puedan ser
posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente
potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla
compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra
molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha
demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos
de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias ya
existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la
obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación
de biomoléculas.
Cromatografía de
penetrabilidad.
El componente básico es una columna empaquetada con una
matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de
estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos
equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de
gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más
rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los
poros de la matriz.
Al principio del desarrollo de la
técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones
estaba restringido debido a los elevados tiempos de separación y su poca
resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a
elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación
de biomoléculas en función de su forma y tamaño.
Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la
separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio
reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos
covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo,
un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador
iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar
al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución
interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador
iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas
positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir
el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y
luego las de mayor carga negativa neta.
Una modificación de este método es la extracción en fase
sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada
en columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja
salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va incrementando la
concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se
eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y
eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).
Cromatografía de adsorción. Se basa en la adsorción y desorción de
los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones
nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de
moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas.
Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta
ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las
sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas
condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la
membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos
y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra
durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de
la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales
(ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa
hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.
Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre
las moléculas de los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los
mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación
mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se
obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos
posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacion, blotting, clonaje, etc.
TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN.
La hibridación es la unión complementaria de ácidos
nucléicos (ADN o ARN). Técnicas de hibridación se utilizan a menudo para detectar
una molécula diana partiendo de una sonda complementaria a ella, también se
usan habitualmente en el diagnóstico de enfermedades, la identificación de
microorganismos patógenos, el estudio de perfiles de expresión génica, la localización
de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridación in situ) o en la comparación
de especies hibridando su ADN.
Se parte de dos poblaciones de ácidos nucléicos: un conjunto
homogéneo de ácidos nucléicos de secuencia conocida que actúa como sonda y otro
conjunto heterogéneo de ácidos nucléicos de secuencia desconocida donde
queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estar marcada. Si lo
está la sonda, la hibridación es estándar. Si lo está la diana, la hibridación
es reversa. Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, bien
procedentes de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restricción, bien
oligonucleótidos sintéticos. Durante la hibridación se produce la unión de las
moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de la complementariedad
de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración de cloruro
sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque
existan algunas bases no complementarias
SOUTHERN BLOT
El Southern Blot es una técnica
que permite la identificación de secuencias específicas
de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación
utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosoma ésta
debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación
ó enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de
mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez
terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan
a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.A continuación, el
filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea
identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que
reconocerá la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del
reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El traspaso
de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el
reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en
el gel es muy ineficiente.
NORTHEN BLOT
El Northern Blot es una técnica
muy similar al Southern Blot que permite la identificación
desecuencias específicas de RNA. La muestra de RNA a analizar no requiere
fragmentación y se somete a electroforesis en geles de agarosa, donde las
moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño. Una vez terminada
la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro
de nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una
sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta
sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá
a la secuencia de RNA inmovilizada en el filtro, a través del
reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos
TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES.
La técnica que
permite clonar el ADN (ácido desoxirribonucleico) que forma los genes se
denomina tecnología del ADN
recombinante, y permite producir segmentos idénticos de genes en grandes
cantidades.
Básicamente
consiste en la obtención del inserto de ADN que interesa, mediante la
utilización de las endonucleasas de restricción; después, se promueve la unión
de éste a un ADN vector (que puede ser un plásmido o un ADN viral), el cual
actúa como vehículo de clonaje, ya que transporta el inserto de ADN a una
molécula hospedadora donde puede ser replicado; y finalmente, la
transformación, que se produce en una célula procariótica o eucariótica.
PRUEBA DE PCR EN EL
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
El diagnóstico de muchas
enfermedades hereditarias necesita una confirmación a nivel molecular del
defecto genético que presenta el paciente. Una vez detectada la mutación y
confirmado el diagnóstico clínico, podemos determinar cuál es el efecto de
dicha mutación en la proteína codificada (cambio de conformación, alteración o
pérdida de función, localización errónea, disminución en su expresión, etc.), y
así poder abrir puertas a nuevas terapias dirigidas al defecto específico
Una de las mayores ventajas de la PCR radica en la facilidad
de efectuar un diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se pueden
conseguir por medio de métodos como cepillado, aspiración, biopsia e incluso a
partir de material de archivo fijado o embebido en parafina. Su elevada
sensibilidad es la característica que permite demostrar las mutaciones
causantes de enfermedades, además de funcionar como marcador biológico de
diagnóstico temprano en cáncer y en la identificación de agentes patógenos en medios
diluidos
Algunas pruebas diagnósticas de rutina que se
fundamentan en la PCR, son las diseñadas para identificar distrofias musculares
de tipo Duchenne o Becker. Estas pruebas examinan la presencia de mutaciones en
la región promotora del gen de la distrofina, así como la deleción de exones en
el mismo, hechos que en cualquier caso son responsables de generar una proteína
anómala
Tecnología del ADN Recombinante
La
tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes,
especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Estas
investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los
cuales tienen profundas implicancias éticas.
La
tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir
material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore
dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología
desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los
ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de
restricción con la micromanipulación (conjunto de técnicas que permiten
inyectar y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva
tecnología, que ha abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la
genética molecular.
La
Tecnología del DNA recombinante se originó en los comienzos de 1970 con el descubrimiento
de las endonucleasas de restricción, enzimas capaces de realizar el clivaje específico
del DNA en fragmentos determinados.
ENZIMAS
DE RESTRICCIÓN:
Las
enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una
forma específica puentes fosfodiéster 3'
- 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de DNA.
Las
enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas
por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens.
Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al
genero (E) y las otras dos a la especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la
designación de una cepa ( R) y un número romano (I) para indicar el orden del
descubrimiento.
El
tipo más común de enzimas de restricción (tipo II) usado en la tecnología del DNA
recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energía para el
clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unión específica al
DNA y posterior clivaje
Las
enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos o adherentes son generados
cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de
cada hebra de simple cadena complementarias entre sí. Los extremos cohesivos o
adherentes son particularmente útiles en la construcción de moléculas de ADN
híbridas o quiméricas. Por otro lado,
los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el
mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
DNA
LIGASA.
La
DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre
los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la
enzima requiere Mg++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la
DNA ligasa del bacteriófago T4.
La
enzima T4 puede unir covalentemente moléculas de DNA con extremos cohesivos
compatibles (por ejemplo, unión de hidrógeno del extremo más largo 5' de EcoRI digiriendo
fragmentos de DNA) y también fragmentos de DNA con extremos sin punta.
El
uso en la digestión / restricción del DNA seguido por unión covalente de extremos
cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimología del DNA
recombinante.
PLÁSMIDOS
Y CLONACIÓN DE DNA EXTRAÑO.
Los
plásmidos son pequeñas moléculas de DNA (de 5.000 pb aproximadamente) que se
replican en forma autónoma en células bacterianas. Son círculos covalentemente
cerrados de DNA de doble cadena. La mayoría de los plásmidos contienen genes
resistentes a antibióticos, los que permiten el crecimiento de células
bacterianas refugiando a los plásmidos bajo condiciones selectivas.
Los
plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces
de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les
permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Debido a su tamaño
relativamente pequeño, los plásmidos contienen solo algunos únicos sitios de
clivaje de enzimas de restricción. Luego de la digestión de un plásmido en un
único sitio de restricción el plásmido circular se vuelve lineal.
Se
puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso
consta de las siguientes etapas:
1.
Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos
cohesivos.
2.
Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los extremos del plásmido
y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.
3.
Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN ligasa
y luego se introduce el plásmido inserto en bacterias.
4.
Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos.
Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al
exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el
plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo
tengan morirán. Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de
copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una
sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la
colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación.
La
unión por la DNA ligasa forma una molécula de DNA recombinante con una
estructura covalentemente cerrada. Una molécula recombinante circular puede ingresar a la célula bacteriana,
replicarse y por virtud el gen del plásmido con resistencia a antibióticos, transformar
la célula normal sensitiva a una que crecerá en presencia de antibióticos.
Si
la unión es realizada en un tubo de prueba con millones de moléculas plásmidas digeridas
por EcoRI y millones de fragmentos de DNA extraño único con extremos cohesivos (por
ejemplo genoma humano digerido con EcoRI) son formadas millones de moléculas de
DNA recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector plásmido pero con un
fragmento único (gen en algunos casos) de DNA humano.
BIBLIOGRAFIA
tarea unidad 9
¿Las bacterias de diferentes especies pueden
compartir plásmidos naturalmente?
Si, por que las bacterias tienen
una gran capacidad de introducir material genético en su célula, para que la transformación
se pueda llevar a cabo la bacteria debe encontrarse en estado de competencia, que
es cuando se produce una proteína especifica llamada factor de competencia, y a la bacteria se le denomina competente. En
este estadio también es donde la bacteria presenta alteración en su pared y
membrana celular y es así como permite el paso de ácidos nucleícos del
exterior.
Para
que las bacterias puedan compartir plásmidos se necesita que la bacteria donadora
por llamarle así este sufriendo un desequilibrio en su célula la cual permita
que el plásmido salga de ella y pueda introducirse fragmentos de ella en la
otra célula receptora. Y es así como hay una transformación y recombinación del
material genético.
Por ejemplo
Bacillus, Haemophilus,
Neisseria, Pneumococcus y Streptococcus
pneumoniae
BIBLIOGRAFIA
- § http://ciencia.glosario.net/biotecnologia/transformaci%F3n-bacteriana-10201.html
- § http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter8.htm
- §http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimicabiolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%20CON%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
- § http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/25_micro.htm
tarea unidad 8
¿Cómo se realiza el control genético del gen BRCA?
Primeramente
cabe mencionar que el gen BRCA es el causante el cáncer de mama, este a su vez
puede dividirse en dos en BRCA 1 y el BRCA 2 el primero causa la enfermedad de cáncer
de mama y el ovárico.
El control
genético se relaciona con un oncogenen que es un gen anormal que produce mutaciones, este es
responsable de la transformación de células normales a células malignas
causando así tumores. El BRCA 1 es un gen supresor de un tumor (cáncer) este se
muestra cuando la proteína del gen p53
sufre una mutación en la replicación y esta deja de sintetizar factores
supresores de la replicación de manera espontanea y sin regulación física ya
que su función principal del gen p53 (17 p 13) es la regulación del ciclo
celular y se le llama guardián del genoma, todo esto es de manera normal, mientras de de
haberse dañado se produce una inestabilidad entre el material genético y es así
como no pueden seguir sintetizando células represoras y comienzan a ser dañadas
las células normales a malignas causando así el tumor entre las mujeres que se
ha alterado su ADN.
El cáncer de mama es la neoplasia más común entre las mujeres
del mundo occidental, con una incidencia media del 10%. Aunque suele aparecer de forma esporádica en
mujeres de edad avanzada, existe un 5%-10% de casos que se consideran de tipo
familiar y son atribuibles a mutaciones en genes de predisposición que se
heredan de forma «aparentemente» dominante.
BIBLIOGRAFIA
- http://es.scribd.com/doc/43870378/GENETICA-ARENA
- http://www.arenamir.com/mironline/ctl_servlet?_f=4000&id=141
- http://books.google.com.mx/booksid=zg9DdX1X1IoC&pg=PA35&dq=control+genetico+del+gen+BRCA&hl=es&sa=X&ei=fVLNT4vREuqQ2AWV4OSPAg&ved=0CDgQ6AEwAA#v=onepage&q=control%20genetico%20del%20gen%20BRCA&f=false
conclusión unidad 9
CONCLUSIÓN
En esta
unidad que se desarrollo aprendí las diferentes formas en que las células bacterianas
pueden introducir material genético ya sea del exterior como es en el caso de transformación
o por medio de bacteriófagos a lo cual se le llama transducción, pero también puede
ser por otro mecanismos que es la conjugación esto se realiza entre dos células
mediante un puente o un Pili que conecta a ambas células y es por ahí donde se
introduce el material genético. Estos mecanismos son de manera natural y de
manera artificial es la biobalistica que sirve para introducción ADN a células vegetales,
así también como la micro inyección esta técnica es utilizada para células animales
y por último la electroporación que es para células bacterianas.
miércoles, 30 de mayo de 2012
unidad 9
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
UNIDAD
9: TRANSFERENCIA DEL MATERIAL GENETICO.
QUE PRESENTA:
ELVIRA ROJAS NAVA.
09930053
LICENCIATURA EN BIOLOGIA
CIUDAD
ALTAMIRANO GRO. MEXICO, MAYO DEL 2012
INTRODUCCION.
Las
bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación a
diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta
capacidad es importante conocer sus bases genéticas, es decir como está
organizada la información genética, como realizan y regulan su expresión y que
mecanismos de variación génica poseen.
La
capacidad infecciosa de las bacterias patógenas radica en que poseen la
información génica necesaria para colonizar los tejidos del huésped, invadirlos
y/o producir sustancias tóxicas que causarán la enfermedad.
Por
otro lado, el conocimiento del funcionamiento genético de las bacterias, sumado
al hecho de que son de fácil manejo en
el laboratorio y que tienen crecimiento rápido, ha permitido usarlas para
sintetizar productos útiles a la medicina, tanto para el diagnóstico como para
la prevención y tratamiento de algunas enfermedades. Estas posibilidades se han
visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniería genética y la
disponibilidad de técnicas de biología molecular.
La
transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas
competentes), son capaces de incorporar ADN exógeno proveniente de otras
bacterias, que está libre en el medio.
OBJETIVO
EDUCACIONAL:
˜ Entender las bases moleculares del intercambio
del material genético entre los diferentes seres vivos para su posterior
aplicación.
9.1 MECANISMOS DE
TRANSFERENCIA NATURAL:
En ocasiones, la célula bacteriana tiene la oportunidad
de intercambiar información genética por procesos de recombinación. Estos
procesos son:
Transformación
la transducción
la conjugación.
En estos procesos no hay formación de ningún tipo de
gametos, por lo que no es reproducción sexual.
TRANSFORMACIÓN.
La transformación se
puede definir como la variación hereditaria de una célula bacteriana
susceptible, originada por la captación de ADN desnudo libre en el medio, con la posterior
recombinación del exogenote con el genomio de la célula en cuestión
(endogenote). Tras la transformación, la célula que ha recibido el ADN se suele
denominar transformante.
Transformación:
fragmentos de adn que pertenecían a células lisadas (rotas) se introducen en
células normales. el adn fragmentado recombina con el adn de la célula
receptora, provocando cambios en la información genética de ésta.
TRANSFORMACION
POR ELECTROPORACIÓN
Aumento
de la conductividad electrica y la
permeabilidad de la membrana causado por un campo eléctrico aplicado externamente,
formando poros.
TRANSDUCCIÓN.
Transducción: cuando una célula es atacada por un virus bacteriófago,
la bacteria genera nuevas copias del adn vírico. En la fase de ensamblaje se
pueden introducir fragmentos de adn bacteriano en la cápsida del virus. los
nuevos virus ensamblados infectarán nuevas células. Mediante este mecanismo,
una célula podrá recibir adn de otra bacteria e incorporar nueva información.
Existen dos tipos de transducción:
a) Transducción generalizada: está
determinada por el intercambio de cualquier
gen bacteriano.
b) Transducción especializada: solamente
determina el intercambio de un número limitado de genes específicos.
La mayoría de los fagos transductores es
capaz de realizar solamente uno de estos tipos de transducción, pero un número
limitado puede realizar ambos.
Los bacteriófagos
son virus que parasitan bacterias. Tienen una estructura compleja formada por
una cabeza, que contiene el material genético, y una cola que consta de unas
fibras con las que se anclan a la superficie bacteriana. El material genético
del bacteriófago pasa desde la cabeza, a través de la cola, hasta el interior
de la bacteria.
El material
genético del virus se integra dentro del material genético bacteriano y se
replica. De esta manera el virus se reproduce y forma nuevos bacteriófagos que
acaban provocando que la bacteria se destruya y estalle.
CONJUGACIÓN
Conjugación: Este
proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información genética para formar pili, puentes que sirven de unión
citoplásmica entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se
denomina F+; la célula que no lo
contiene se llama F-. La
bacteria F+ (donadora de información) se une a una bacteria F- (receptora)
mediante uno de sus pili.
A través de él
introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en
bacteria F+.En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN
bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr. De esta forma la bacteria Hfr puede donar a otras células
cualquier gen de su ADN.
El proceso de conjugación es considerado el
principal camino para la transferencia horizontal de genes de resistencia entre
bacterias. La conjugación la transferencia de material genético extracromosomal requiere el contacto directo entre célula y
célula, lo cual resulta en una transferencia unidireccional del material
genético, de la célula donadora a la receptora. Esto está mediado por plásmidos
conjugativos, aunque los transposones también son capaces de desencadenar
procesos de conjugación
TRANSFECCIÓN.
Las técnicas de transfección celular, que se
han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de ácidos
nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar
los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las
proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de
aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la
selección de líneas celulares modificadas, etc
Las
técnicas de transfección actuales se pueden clasificar en los llamados métodos
físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr
la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.
Las
diferencias entre métodos químicos y físicos se encuentran a nivel
metodológico, no a nivel de resultados, ya que el conjunto de métodos físicos
no se basa en ningún sistema biológico, sino que pretende una inserción a “la
fuerza”, de ese material genético. También hay que decir que este conjunto de
técnicas sólo es funcional in vitro, ya que es necesaria la exposición de las
células a medios extremos.
9.2 MECANISMOS DE TRANFERENCIA ARTIFICIAL.
FISICOS:
v Biobalistica
v Micro inyección
v Electroporación.
La biobalística
es uno de los métodos directos de transformación más usados en la actualidad.
Se basa en disparar hacia el núcleo de las células a transformar, con alta
aceleración, pequeños proyectiles con ADN adherido en su superficie,
permitiendo así la incorporación de ADN foráneo al ADN de la célula
Microinyección: Es el método que se emplea en
la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso
de obtención de animales transgénicos.
La electroporación: las bacterias se someten a
un campo eléctrico que desestabiliza a las estructuras de pared y membrana.
Durante este proceso se inducen poros temporarios por los que ingresa el DNA en
las bacterias. En este caso no es necesario inducir el “estado de competencia”
previamente, simplemente las bacterias de un cultivo en fase logarítmica de
crecimiento se lavan varias veces para eliminar todas las sales que puedan
estar presentes.
QUÍMICOS.
Basados en la formación de complejos que las
células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante
la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas
(lipofección).
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado en la obtención de un precipitado
entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. Se precipitan formando unos
agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el
agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas
celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del
proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH
de la solución, etc...
MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.
Basado en la obtención de complejos entre la
resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite
unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se
introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El
uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.
MÉTODO DE LIPOFECCIÓN.
Se basa en la formación de complejos entre
lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite
la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación
de liposomas a la membrana y la entrada flipflap. Existen un gran número de
lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de
un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas
variantes (por ej. DOPE).
BIBLIOGRAFIA.
› http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/transferencia-de-material-genetico-ii-2.pdf
› http://www.fca.uner.edu.ar/academicas/deptos/catedras/microbiologia/unidad_6_genetica_microbiana.pdf
› http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S037818442004000500007&script=sci_arttex
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