ELVI: junio 2012

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

UNIDAD 10: TECNICAS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

QUE PRESENTA:

ELVIRA ROJAS NAVA.

09930053

LICENCIATURA EN BIOLOGIA 6° SEMESTRE.

CIUDAD ALTAMIRANO GRO. MEXICO, JUNIO DEL 2012

INTRODUCCIÓN.

Las células son las unidades funcionales de cualquier organismo vivo. Las instrucciones necesarias para dirigir sus actividades están contenidas en los cromosomas del núcleo celular y son conocidas en su conjunto como información genética. La información genética se encuentra almacenada en el acido desoxirribonucleico (DNA) en forma de un código, denominado código genético. Un segmento de DNA de localización cromosómica precisa que contiene el código para un producto (proteína o RNA) de función definida se denomina gen. La información del gen es transferida a los diferentes compartimentos celulares a través del ácido ribonucleico (RNA) y es transmitida de una célula madre a las hijas por duplicación del material genético (DNA).

Los procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisión de la información genética en la célula constituyen la materia de estudio de la biología molecular. La biología molecular puede ser definida como una disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular. Se fundamenta en un “dogma central”, que establece el flujo de la información genética en la célula (DNA, RNA y Proteína).

Para el estudio de la transferencia y la transmisión de la información genética, los biólogos moleculares han desarrollado técnicas que permiten la manipulación de los ácidos nucleicos (DNA y RNA), denominadas técnicas del DNA recombinante; con este mismo fin han propuesto y perfeccionado procedimientos para el estudio de los productos de la expresión de los genes (RNA y proteínas).

La medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las técnicas de la biología molecular en el estudio de las enfermedades humanas.

El impacto de la biología molecular en las ciencias médicas se vio potenciado por el “Proyecto Genoma Humano”, investigación multinacional que estableció la secuencia de bases del DNA contenido en los cromosomas humanos. El Proyecto del Genoma Humano ha logrado determinar el orden preciso de los cerca de 3,200 millones de nucleótidos del genoma y elaborar un mapa que ubica a sus 30 a 40 mil genes. Para la medicina, el conocimiento de la secuencia completa del DNA humano constituye una poderosa herramienta para la investigación en biomedicina que ha permitido el avance en el conocimiento de la patogenia, el desarrollo de nuevas terapias y la implementación de métodos diagnósticos precisos

OBJETIVO EDUACIONAL.

Conocer y aplicar las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.

DESARROLLO DE LA UNIDAD

Extracción y purificación de los ácidos nucleicos

Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación especifico para ellas. Estos métodos deben ser completamente bio_compatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas.

Cromatografía de penetrabilidad.

El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.

Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño.

Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).

Cromatografía de adsorción. Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.

Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacion, blotting, clonaje, etc.

TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN.

La hibridación es la unión complementaria de ácidos nucléicos (ADN o ARN). Técnicas de hibridación se utilizan a menudo para detectar una molécula diana partiendo de una sonda complementaria a ella, también se usan habitualmente en el diagnóstico de enfermedades, la identificación de microorganismos patógenos, el estudio de perfiles de expresión génica, la localización de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridación in situ) o en la comparación de especies hibridando su ADN.

Se parte de dos poblaciones de ácidos nucléicos: un conjunto homogéneo de ácidos nucléicos de secuencia conocida que actúa como sonda y otro conjunto heterogéneo de ácidos nucléicos de secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estar marcada. Si lo está la sonda, la hibridación es estándar. Si lo está la diana, la hibridación es reversa. Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, bien procedentes de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restricción, bien oligonucleótidos sintéticos. Durante la hibridación se produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de la complementariedad de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración de cloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existan algunas bases no complementarias

SOUTHERN BLOT

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosoma ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación ó enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.

NORTHEN BLOT

El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación desecuencias específicas de RNA. La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño. Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia de RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos

TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES.

La técnica que permite clonar el ADN (ácido desoxirribonucleico) que forma los genes se denomina tecnología del ADN recombinante, y permite producir segmentos idénticos de genes en grandes cantidades.

Básicamente consiste en la obtención del inserto de ADN que interesa, mediante la utilización de las endonucleasas de restricción; después, se promueve la unión de éste a un ADN vector (que puede ser un plásmido o un ADN viral), el cual actúa como vehículo de clonaje, ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora donde puede ser replicado; y finalmente, la transformación, que se produce en una célula procariótica o eucariótica.

PRUEBA DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

El diagnóstico de muchas enfermedades hereditarias necesita una confirmación a nivel molecular del defecto genético que presenta el paciente. Una vez detectada la mutación y confirmado el diagnóstico clínico, podemos determinar cuál es el efecto de dicha mutación en la proteína codificada (cambio de conformación, alteración o pérdida de función, localización errónea, disminución en su expresión, etc.), y así poder abrir puertas a nuevas terapias dirigidas al defecto específico

Una de las mayores ventajas de la PCR radica en la facilidad de efectuar un diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se pueden conseguir por medio de métodos como cepillado, aspiración, biopsia e incluso a partir de material de archivo fijado o embebido en parafina. Su elevada sensibilidad es la característica que permite demostrar las mutaciones causantes de enfermedades, además de funcionar como marcador biológico de diagnóstico temprano en cáncer y en la identificación de agentes patógenos en medios diluidos

Algunas pruebas diagnósticas de rutina que se fundamentan en la PCR, son las diseñadas para identificar distrofias musculares de tipo Duchenne o Becker. Estas pruebas examinan la presencia de mutaciones en la región promotora del gen de la distrofina, así como la deleción de exones en el mismo, hechos que en cualquier caso son responsables de generar una proteína anómala

Tecnología del ADN Recombinante

La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Estas investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias éticas.

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de restricción con la micromanipulación (conjunto de técnicas que permiten inyectar y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva tecnología, que ha abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la genética molecular.

La Tecnología del DNA recombinante se originó en los comienzos de 1970 con el descubrimiento de las endonucleasas de restricción, enzimas capaces de realizar el clivaje específico del DNA en fragmentos determinados.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

Las enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de DNA.

Las enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al genero (E) y las otras dos a la especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la designación de una cepa ( R) y un número romano (I) para indicar el orden del descubrimiento.

El tipo más común de enzimas de restricción (tipo II) usado en la tecnología del DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energía para el clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unión específica al DNA y posterior clivaje

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos o adherentes son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarias entre sí. Los extremos cohesivos o adherentes son particularmente útiles en la construcción de moléculas de ADN híbridas o quiméricas. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.

DNA LIGASA.

La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la enzima requiere Mg++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa del bacteriófago T4.

La enzima T4 puede unir covalentemente moléculas de DNA con extremos cohesivos compatibles (por ejemplo, unión de hidrógeno del extremo más largo 5' de EcoRI digiriendo fragmentos de DNA) y también fragmentos de DNA con extremos sin punta.

El uso en la digestión / restricción del DNA seguido por unión covalente de extremos cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimología del DNA recombinante.

PLÁSMIDOS Y CLONACIÓN DE DNA EXTRAÑO.

Los plásmidos son pequeñas moléculas de DNA (de 5.000 pb aproximadamente) que se replican en forma autónoma en células bacterianas. Son círculos covalentemente cerrados de DNA de doble cadena. La mayoría de los plásmidos contienen genes resistentes a antibióticos, los que permiten el crecimiento de células bacterianas refugiando a los plásmidos bajo condiciones selectivas.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Debido a su tamaño relativamente pequeño, los plásmidos contienen solo algunos únicos sitios de clivaje de enzimas de restricción. Luego de la digestión de un plásmido en un único sitio de restricción el plásmido circular se vuelve lineal.

Se puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las siguientes etapas:

1. Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.

2. Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.

3. Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN ligasa y luego se introduce el plásmido inserto en bacterias.

4. Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán. Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación.

La unión por la DNA ligasa forma una molécula de DNA recombinante con una estructura covalentemente cerrada. Una molécula recombinante circular puede ingresar a la célula bacteriana, replicarse y por virtud el gen del plásmido con resistencia a antibióticos, transformar la célula normal sensitiva a una que crecerá en presencia de antibióticos.

Si la unión es realizada en un tubo de prueba con millones de moléculas plásmidas digeridas por EcoRI y millones de fragmentos de DNA extraño único con extremos cohesivos (por ejemplo genoma humano digerido con EcoRI) son formadas millones de moléculas de DNA recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector plásmido pero con un fragmento único (gen en algunos casos) de DNA humano.

BIBLIOGRAFIA

› http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/pdf%20solu/Soluciones-QPCR-protocolos.pdf

› http://es.scribd.com/doc/42688374/Tecnicas-de-hibridacion

› http://agronlin.tripod.com/dat/id6.html

› http://www.sccalp.org/documents/0000/0154/BolPediatr2008_48_235-241.pdf

› http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S1657-95342009000300011&script=sci_arttext

› http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/dnarec07.pdf

› http://www.slideshare.net/Cristelayt/tecnologa-del-adn-recombinante-2907625