ELVI: UNIDAD 4

INSTITUTO TECNOLOGICO

DE CD. ALTAMIRANO GRO

LIC: BIOLOGIA

MATERIA: BIOLOGIA MOLECULAR.

PRESENTA:

ELVIRA ROJAS NAVA.

VI SEMESTRE

PROFESOR:

FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA.

CD.ALTAMIRANO, GRO. 05/ 03/2012

UNIDAD 4: REPLICACIÓN DEL ADN.

INTRODUCCIÓN.

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es es esencialmente el mismo en todas las células. Es un proceso semiconservativo porque cada uno de los dos ADN hijos tiene una cadena del ADN anteriores.

EN LAS CÉLULAS PROCARIOTAS.

Hay 1 lugar de origen de replicación que se muestra en la horquilla de replicación (replication fork) y que señala el avance de la copia. La horquilla (fork) indica que se está haciendo la separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado replisma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo.

EN LAS CÉLULAS EUCARIOTAS

El proceso es esencialmente el mismo pero el ADN es mucho más grADNe y linear. Hay varios orígens de replicación y es bidireccional. El avance es más lento que en procariotas ya que hay más proteínas asociadas al ADN que hay que soltar. La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada genración celular necesita de muchos "ladrillos", enzimas y una gran cantidad de energía en forma de ATP (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular , las células pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energía para la siguiente fase de la división celular). La replicación del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo. Los nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

Una vez que se abre la molécula, se forma una área conocida como "burbuja de replicación" en ella se encuentran las "horquillas de replicación" . Por acción de la la ADN polimerasa los nuevos nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas".

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección 5' to 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos han mostrado que, una cadena formará una copia continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki . La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena guía, delantera ó adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada ó rezagada.

Los fragmentos cortos, recién sintetizados de hebras de ADN se denominan fragmentos Okazaki. Todas las ADN polimerasas conocidas, pueden sólo sintetizar ADN en la dirección 5' a 3' . Sin embargo, cuADNo las hebras se separan, la horquilla de replicación se desplaza a lo largo de una hebra molde en la posición 3' a 5' y 5' a 3' en el otro lado del molde.

En la primera , la cadena adelantada de ADN es sintetizada continuamente en la dirección 5' a 3'. En la otra, llamada la cadena atrasada, la síntesis de ADN sólo ocurre cuADNo una sección de una hebra simple de ADN ha sido expuesta y procede en la dirección opuesta a la dirección de la horquilla de replicación (5' to 3'). Es por ésto discontinua y la serie de fragmentos Okazaki son unidos de manera covalente por las ligasas formADNo una hebra continua. Se denominan fragmentos Okazaki porque fué éste investigador quien primeramente los observó y estudió ADN o timidina radioactiva . En los eucariotas, los fragmentos Okazaki están formados por unos cuantos cientos de nucleótidos, mientras que en los procariotas estos fragmentos pueden alcanzar algunos miles.

Para que la ADN polimerasa trabaje, se necesaria la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, ADN la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y una ADN ligasa que los une a la cadena en crecimiento.

OBJETIVOS DE LA UNIDAD:

Entender cómo se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia

Distinguir los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariotas.

EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL.

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, ellos diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N¹⁵, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N¹⁵. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N¹⁵).

Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N¹⁴) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N¹⁵.

Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N¹⁵ era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N¹⁴. Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma:

Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N¹⁵) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N¹⁴ (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.

Cuando extraían el ADN de la bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N^14-15)entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N¹⁴ y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La absorbancia a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N¹⁴ era tres veces mayor que la encontrada en la banda de densidad intermedia (N^14-15), proporción (3:1).

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N¹⁴, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N¹⁵ (la vieja) y la otra hélice con N¹⁴ (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N¹⁵ y otra menos densa sintetizada con N¹⁴.

Esquema Experimentos Meselson y Stahl (1958)